3 重组人干扰素α2b喷雾剂(假单胞菌)药典标准
3.1 品名
3.1.1 中文名
3.1.2 汉语拼音
Chongzu Ren Ganraosu α2b Penwuji (Jiadanbaojun)
3.1.3 英文名
Recombinant Human Interferon α2b Spray (P.putida)
3.2 定义、组成及用途
本品系由高效表达人干扰素α2b基因的腐生型假单胞菌,经发酵、分离和高度纯化后获得的重组人干扰素α2b制成。含适宜稳定剂、防腐剂。
3.3 1 基本要求
生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
3.4 2 制造
3.4.1 2.1 工程菌菌种
3.4.1.1 2.1.1 名称及来源
重组人干扰素α2b工程菌株系由带有人干扰素α2b基因的重组质粒转化的腐生型假单胞菌菌株。
3.4.1.2 2.1.2 种子批的建立
3.4.1.3 2.1.3 菌种检定
3.4.1.3.1 2.1.3.1 划种LB琼脂平板
3.4.1.3.2 2.1.3.2 染色镜检
应呈棒状,可运动,有荚膜,无芽孢。涂片染色后应呈典型的革兰氏阴性。
3.4.1.3.3 2.1.3.3 对抗生素的抗性
应与原始菌种相符。
3.4.1.3.4 2.1.3.4 电镜检查(工作种子批可免做)
应为典型腐生型假单胞菌形态,无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。
3.4.1.3.5 2.1.3.5 生化反应
不液化明胶,不水解淀粉和聚β-羟基丁酸酯(2010年版药典三部附录XIV),不能利用反硝化作用进行厌氧呼吸,能够合成荧光色素。
3.4.1.3.6 2.1.3.6 干扰素表达量
在摇床中培养,应不低子原始菌种的表达量。
3.4.1.3.7 2.1.3.7 表达的干扰素型别
3.4.1.3.8 2.1.3.8 质粒检查
3.4.1.3.9 2.1.3.9 目的基因核苷酸序列检查(工作种子批可免做)
3.4.2 2.2 原液
3.4.2.1 2.2.1 种子液制备
将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基(可含适量抗生素)中培养。
3.4.2.2 2.2.2 发酵用培养基
3.4.2.3 2.2.3 种子液接种及发酵培养
2.2.3.2 在适宜的温度下进行发酵,应根据批准的发酵工艺进行,并确定相应的发酵条件,如温度、pH值、溶解氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质粒丢失率检查(2010年版药典三部附录Ⅸ G)。
3.4.2.4 2.2.4 发酵液处理
用高速离心法收集、处理菌体。收集到的菌体可在-20℃以下保存,保存时间应不超过1年。
3.4.2.5 2.2.5 初步纯化
采用经批准的纯化工艺进行初步纯化,使其纯度达到规定的要求。
3.4.2.6 2.2.6 高度纯化
经初步纯化后,采用经批准的纯化工艺进行高度纯化,使其达到3.1项要求,即为重组人干扰素α2b原液。除菌过滤后于适宜温度下保存,并规定其有效期。
3.4.2.7 2.2.7 原液检定
按3.1项进行。
3.4.3 2.3 半成品
3.4.3.1 2.3.1 配制
3.4.3.1.1 2.3.1.1 稀释液配制
按经批准的配方配制稀释液,按经批准的工艺进行稀释液的灭菌。冷却后应立即用于稀释。
3.4.3.1.2 2.3.1.2 稀释
将检定合格的含稳定剂的重组人干扰素α2b原液用2.3.1.1项稀释液稀释至所需浓度,即为半成品,于2~10℃保存。
3.4.3.2 2.3.2 半成品检定
按3.2项进行。
3.4.4 2.4 成品
3.4.4.1 2.4.1 分批
3.4.4.2 2.4.2 分装
应符合“生物制品分装和冻干规程”及2010年版药典三部附录Ⅰ H有关规定。
3.4.4.3 2.4.3 规格
应为经批准的规格。
3.4.4.4 2.4.4 包装
应符合.“生物制品包装规程”及2010年版药典三部附录Ⅰ H有关规定。
3.5 3 检定
3.5.1 3.1 原液检定
3.5.1.1 3.1.1 生物学活性
依法测定(2010年版药典三部附录Ⅹ C)。
3.5.1.2 3.1.2 蛋白质含量
依法测定(2010年版药典三部附录Ⅵ B第二法)。
3.5.1.3 3.1.3 比活性
为生物学活性与蛋白质含量之比,每1mg蛋白质应不低于1.0×108IU。
3.5.1.4 3.1.4 纯度
3.5.1.4.1 3.1.4.1 电泳法
依法测定(2010年版药典三部附录Ⅳ C)。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,分离胶胶浓度为15%,加样量应不低于10μg(考马斯亮蓝R250染色法),或5μg(银染法)。经扫描仪扫描,纯度应不低于95.0%。
3.5.1.4.2 3.1.4.2 高效液相色谱法
依法测定(2010年版药典三部附录Ⅲ B)。色谱柱以适合分离分子质量为5~60kD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂;流动相为0.1mol/L磷酸盐-0.1mol/L氯化钠缓冲液,pH7.0;上样量应不低于20μg,在波长280nm处检测,以干扰素色谱峰计算的理论板数应不低于1000。按面积归一化法计算,干扰素主峰面积应不低于总面积的95.0%。
3.5.1.5 3.1.5 分子量
依法测定(2010年版药典三部附录Ⅳ C)。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,分离胶胶浓度为15%,加样量应不低于1.0μg,制品的分子质量应为19.2kD±1.9kD。
3.5.1.6 3.1.6 外源性DNA残留量
每1次人用剂量应不高于10ng(2010年版药典三部附录Ⅸ B)。
3.5.1.7 3.1.7 宿主菌蛋白质残留量
应不高于蛋白质总量的0.10%(2010年版药典三部附录Ⅸ D)。
3.5.1.8 3.1.8 残余抗生素活性
依法测定(2010年版药典三部附录Ⅸ A),不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。
3.5.1.9 3.1.9 等电点
主区带应为5.7~6.7,且供试品的等电点图谱应与对照品的一致(2010年版药典三部附录Ⅳ D)。
3.5.1.10 3.1.10 紫外光谱
用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至约100~500μg/ml,在光路1cm、波长230~360nm下进行扫描,最大吸收峰波长应为278nm±3nm(2010年版药典三部附录Ⅱ A)。
3.5.1.11 3.1.11 肽图
依法测定(2010年版药典三部附录Ⅷ E),应与对照品图形一致。
3.5.1.12 3.1.12 N端氨基酸序列(至少每年测定1次)
Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Ser-Arg-Arg-Thr-Leu。
3.5.2 3.2 半成品检定无菌检查
依法检查(2010年版药典三部附录Ⅻ A),应符合规定。
3.5.3 3.3 成品检定
3.5.3.1 3.3.1 鉴别试验
按免疫印迹法(2010年版药典三部附录Ⅷ A)或免疫斑点法(2010年版药典三部附录Ⅷ B)测定,应为阳性。
3.5.3.2 3.3.2 物理检查
3.5.3.2.1 3.3.2.1 外观
应为无色或微黄色、略带黏稠的液体。
3.5.3.2.2 3.3.2.2 装量
依法检查(2010年版药典三部附录Ⅰ H),应符合规定。
3.5.3.3 3.3.3 化学检定
3.5.3.3.1 pH值
应为5.0~7.5(2010年版药典三部附录Ⅴ A)。
3.5.3.4 3.3.4 生物学活性
应为标示量的80%~150%(2010年版药典三部附录Ⅹ C)。
3.5.3.5 3.3.5 无菌检查
依法检查(2010年版药典三部附录Ⅻ A),应符合规定。
3.5.3.6 3.3.6 每瓶总喷次
依法测定(2010年版药典三部附录Ⅰ H),应符合规定。
3.5.3.7 3.3.7 每喷喷量
依法测定(2010年版药典三部附录Ⅰ H),应符合规定。
3.6 4 保存、运输及有效期
于2~10℃避光保存和运输。自生产之日起,按批准的有效期执行。
3.7 5 使用说明
3.8 版本
《中华人民共和国药典》2010年版