3 原理
血红蛋白(Hb)中的亚铁离子(Fe2+)被高铁氰化钾氧化成高铁离子(Fe3+),血红蛋白转化成高铁血红蛋白。高铁血红蛋白与氰离子(CN-)结合,生成稳定的氰化高铁血红蛋白,在540 nm波长处有一个较宽的吸收峰,在该波长处测得的吸光度(A)与溶液中浓度成正比。以测得的样品吸光度值与氰化高铁血红蛋白标准液吸光度值比较,得出样品血红蛋白含量。[1]
4 器材
75%酒精,酒精棉球,消毒的干棉球,一次性无菌采血针,经标定合格的一次性微量血红蛋白吸管,一次性10 mL塑料试管,可见光分光光度比色计,光径1.0 cm比色杯。
采血针与微量血红蛋白吸管应一人一换,不得重复使用。医疗废物应按照卫生部颁布的《医疗卫生机构医疗废物管理办法》进行处理。
5 试剂
a) 四种浓度的氰化高铁血红蛋白标准液:50 g/L、100 g/L、150 g/L、200 g/L。
b) 市售氰化高铁血红蛋白试剂,用蒸馏水按比例要求稀释,贮存于棕色玻璃瓶中备用。
或配制氰化高铁血红蛋白试剂(HiCN试剂):
氰化钾(KCN) 0.050 g
高铁氰化钾[K3Fe(CN)6] 0.200 g
无水磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.140 g
非离子表面活性剂(Triton X-100,Saponic218等) 1.0 mL
上述成分分别溶于蒸馏水中,混合,置1L容量瓶内,再加蒸馏水至1000 mL混匀,储存于棕色玻璃瓶中,置4℃~10℃保存不超过1个月。试剂应为淡黄色透明溶液,pH值在7.0~7.4。若试剂出现混浊则不能使用。本试剂不吸收480nm以上的光波,因此读数与蒸馏水空白一致。
6 操作步骤
a) 血红蛋白测定仪器的校正:以HiCN试剂调零,以50 g/L、100 g/L、150 g/L、200 g/L四种浓度的氰化高铁血红蛋白标准液校正仪器,分别测定在540 nm波长的吸光度。在标准仪器条件下,波长540 nm各浓度吸光度值恒定。若四种浓度标准液吸光度读数误差在允许范围内(表3),血红蛋白含量与吸光度符合式(1):
Hb (g/L) =A×K-A×367.7 …………………………(1)
式中: Hb-血红蛋白值,单位为克每升(g/L);A-吸光度; K-常数,为367.7。
相应Hb真值 | 误差允许范围 | ||
A真值 | g/L | A | H b/(g/L) |
0.136 | 50 | 0.133~ 0.1399 | 49~51 |
0.272 | 100 | 0.267~0.277 | 98~102 |
0.408 | 150 | 0.400~0.416 | 147~153 |
0.544 | 200 | 0.533~0.554 | 196~204 |
氰化高铁血红蛋白标准液吸光度读数若超出表3误差范围,式(1)中的K需要按式(2)校正:
K校正=(∑吸光度真值/∑吸光度读数)×367.7
=(1.360/∑吸光度读数)×367.7 ……….(2)
b) 于10 mL试管中加入5 mL HiCN试剂。
c) 用酒精消毒左手无名指,待干后用一次性无菌采血针向指尖垂直方向穿刺,深约2 mm~3 mm。用一次性微量血红蛋白吸管吸取20 μL血样,管内不得有气泡,擦去管外血液。
d) 置吸管于HiCN试剂中,使管尖在液面下,轻轻自管中推出血液,反复吸取HiCN试剂(3次以上),将管内血液洗净,混匀,静置10 min以上。
10 参考资料
- ^ [1] GB/T 26343—2010, 学生健康检查技术规范[S].