1 检查名称
4 概述
组织纤溶酶原激活物是一种单链糖蛋白,主要由血管内皮细胞合成、分泌,不断释放入血液,广泛存在于机体的各种组织内,肝脏是组织纤溶酶原激活物灭活的主要场所。它对纤维蛋白有高度亲和力,然后将酪氨酸纤溶酶原形成纤溶酶。降解纤维蛋白(原)和部分凝血因子。是纤溶系统的关键物质。
5 原理
(1)活性测定(t-PA∶A,发色底物法之一):血浆优球蛋白部分含有包括t-PA以及全部凝血因子,但不含PA抑制物。加入过量的纤溶酶原与纤维蛋白的共价物,样品中之t-PA易吸附于纤维蛋白,并将血纤溶酶原转变成纤溶酶,后者使发色底物显色。血浆t-Pt-PA与显色的深浅呈正相关。
(2)活性测定(t-PA∶A发色底物法之二):在t-PA和加速剂作用下,纤溶酶原转变为纤溶酶,后者使发色底物S-2390释放出发色基团PNA。PNA显色的深浅与纤溶酶和t-PA呈正比关系。
(3)抗原测定(t-PA∶Ag)ELISA法:本试验根据双抗体夹心法原理,即将纯化的t-PA单克隆抗体包被在固相载体上温育,然后加含有抗原的待测标本。标本中的t-PA抗原与固相载体上的抗体形成复合物。此复合物与过氧化物酶标记的t-PA单克隆抗体起抗原抗体结合反应,形成t-PA-POD复合物。后者可使邻苯二胺基质液呈棕色反应,其反应颜色深浅与标本中t-PA含量呈正比关系。
6 试剂
6.1 (1)活性测定(t-PA∶A,发色底物法之一):
②纤维蛋白-纤溶酶原共价物:375mg/L的纤维蛋白,250μ/L的纤溶酶原。
③发色底物:3mol/L S-2251(H-D-Val-Leu-Lys-PNA)。
⑤0.25%醋酸。
⑥t-PA标准1和2(S15.6IU/ml,S22.8IU/ml)。
6.2 (2)活性测定(t-PA∶A发色底物法之二):
上海医科大学试剂盒。
③人纤溶酶原。
④发色底物S-2390。
⑤浓缓冲液TB。
⑥加速剂。
⑦浓抗凝液。
⑧浓酸化液。
6.3 (3)抗原测定(t-PA∶Ag)ELISA法:
③基质:邻苯二胺。
④基质缓冲液:0.2mol/L柠檬酸,0.2mol/L柠檬酸钠缓冲液。
⑥洗涤液:0.025mol/L氯化钙-Tween-20-PBS缓冲液。
⑨30% H2O2。
7 操作方法
(1)活性测定(t-PA∶A,发色底物法之一):
①血浆处理:按表1进行操作。
②操作方法:按表2进行。
(2)活性测定(t-PA∶A发色底物法之二):
①血浆制备:静脉采血,置于含1/10体积抗凝液的硅化试管中,尽快低温分离血浆。取血浆200μl,加酸化液200μl,混匀,置-30℃保存。测定时酸化血浆作1∶60稀释。
②取去t-PA血血浆和t-PA标准品配制标准t-PA系列(表3)。
③加样:取洁净96孔平底酶标板一块,将上述准备好的待测血浆样品和t-PA标准品加到各孔中,100μl/孔。
④发色底物混合液:将纤溶酶原、发色底物和加速剂混合,立即100μl/孔加至酶标板各孔中。
⑤反应:置湿盒中,37℃温育5h,加50%冰醋酸20μl终止反应。
⑥测定:测定各孔A405。以标准系列中不含t-PA孔调零点,然后读数。
③用基质缓冲液溶解邻苯二胺(8mg/ml),并加入10μl 30% H2O2。
④将t-PA标准倍比稀释成10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125IU/ml。
⑤标本稀释:1份柠檬酸钠抗凝血浆加5份稀释液。如果估计t-PA值增高,血浆作1∶10稀释。
⑥用稀释之t-PA抗体包被ELISA反应板,每孔200μl,温育过夜,然后用洗涤液洗3次。
⑧加过氧化物酶抗体复合物200μl,温育1h后,同上洗涤3次,洗后立即加基质。
⑨每孔加基质200μl,显色10~15min。
⑩加硫酸(3mol/L)50μl或盐酸(1mol/L)100μl,10min中止反应,于492nm,2h内比色,以稀释缓冲液为本底。
⑪据吸光度读数由标准曲线查得t-PA含量。
9 临床意义
(1)活性测定(t-PA∶A,发色底物法之一):
①肝坏死常伴有纤溶活性的异常,由于消除功能障碍,故t-PA∶A往往增高。但同时由于PAI的活性增强故t-PA的活性实际上是降低的。在DIC和伴有血栓形成倾向的疾病往往有t-PA活性减低。冠心病心肌梗死患者PA活性减低。
②先天性t-PA活性增强已有报道。急性早幼粒细胞白血病患者t-PA往往增高。
③遗传性PA活性缺乏为常染色体显性遗传。患者表现为多发性静脉血栓形形形成。
(2)活性测定(t-PA∶A发色底物法之二):
①t-PA∶A增高:表明纤溶活性亢进,见于原发性及继发性纤溶症,如DIC等。
②t-PA∶A减低:表明纤溶活性减弱,见于高凝状态和血栓性疾病。