3 概述
环腺苷酸作为肽类激素的第二信使,在激活蛋白激酶,使核糖体中蛋白质磷酸化,加速“翻译”过程和促进特异性蛋白质的合成等方面起着非常重要的作用。临床上测定环腺苷酸对多种疾病诊断和疗效判断有一定意义。
5 尿环磷腺苷的医学检查
5.1 检查名称
5.2 分类
5.3 尿环磷腺苷的测定原理
cAMP是一种小分子半抗原,其特异性抗体是以人工合成的2'-0-ScAMP-BSA结合物免疫动物所获得。抗体对2'-0-位有取代基的cAMP的亲和力较无取代基的cAMP约大100倍。为提高测定方法的灵敏度高,测定时应将[3H]标记cAMP,样品和标准同时进行琥珀酰化反应,然后和抗体反应。从标准曲线查出样品中的浓度。
5.4 试剂
(1)抗血清:
①ScAMP的合成:取cAMP20mg,琥珀酸酐100mg至反应瓶中,加去离子水2ml,三乙胺0.2ml,磁力搅拌反应30min。置真空干燥内减压除去三乙胺。加水20ml,放24h,用1mol/L NH4OH调至pH7.0。即刻用强碱型聚苯乙烯阴离子交换柱层析。0.3mol/L甲酸淋洗,收集258nm流出液。合并,冷冻干燥,产物为ScAMP。
②取ScAMP:经偶联剂作用和BSA结合,作为免疫原,注射山羊或家兔,制备抗血清。
(2)[3H]-ScAMP:取[3H]-cAMP(中国原子能研究院产品)92.5kBq(2.5μCi)至瓶中,加琥珀酸酐5mg,去离子水0.1ml,三乙胺10μl,即刻混合,用力摇45s,加50mmol/L pH6.2醋酸缓冲液至10ml,临用前配制。
(3)50mmol/L pH6.2醋酸盐缓冲液:取AR级无水醋酸钠4.1g于800ml蒸馏水中,加茶硷1.44g,溶解后用2mol/L醋酸调至pH6.2,加蒸馏水至1000ml,4℃保存。
(4)标准cAMP液(320nmol/L):取纯化cAMP1.11mg,加50mmol/L pH6.2醋酸盐缓冲液10ml,微温至溶,放-20℃可长期保存。
(5)标准cAMP(320pmol/瓶):取标准cAMP液0.2ml至10ml容量瓶中,加去离子水至10ml刻度。取5ml带塞瓶,每瓶加50μl,放37℃干燥,4℃水箱可保存3年内稳定。
(6)酰化试剂:取200mg/ml琥珀酸酐丙酮液2.5ml,三乙胺0.9ml混合,临用前新配。
(7)闪烁液:取PPO 4g,POPOP 100mg,加AR级二甲苯1000ml。
5.5 操作方法
(1)尿液采集:稀释后取尿液3ml,即刻加至预先放有0.25mol/L EDTA Na250μl的冷试管中,迅速混匀,放-20℃保存。
取尿液1ml至提取管中,加无水乙醇3ml,置快速混匀器上1min,离心,上清液倾至15ml蒸发皿中,向沉淀物中加75%乙醇3ml重复提取一次。上清液合并,置55℃水浴上吹干。残渣溶于0.5ml50mmol/L pH6.2醋酸盐缓冲液。
(2)组织样品处理:活组织取得后即刻置氮气中,快速称取30~50mg于研磨器中,加50mmol/LpH6.2醋酸盐缓冲液1ml,制成匀浆后即刻放沸水浴中3~5min。离心,取上清液放-20℃保存。
(3)标准工作液:取标准cAMP一瓶,加50mmol/L pH6.2醋酸盐缓冲液1ml。另取试管7只,各加50mmol/L pH6.2醋酸缓冲液0.5ml,从标准液中吸出0.5ml至第一管,依次作倍比稀释。此系列标准液50μl中含有0.125~8pmol。临用前稀释。
(4)10mm×100mm玻璃试管,NSB管加缓冲液150μl,S0管加缓冲液50μl,S1~7管加不同浓度标准液50μl测定管加待测样品50μl。
(5)向每管加酰化试剂10μl,即刻用力摇5~10s。各管加[3H]-ScAMP液50μl。
(6)除NSB管外,各加抗血清100μl。混匀,放4℃反应2.5h。向每管加冷缓冲液1ml。
(7)将反应液滴加至联接抽气泵的微孔滤膜上抽滤,再加2ml冷缓冲液洗涤反应管,亦加至膜上抽滤。取下滤膜,放80℃ 30min。
(8)将滤膜放至预先加有5ml闪烁液的计数瓶中,放2h后在自动液体闪烁测量仪上测放射性。
(9)以B0/B为纵坐标,标准管浓度为横坐标,在普通方格纸上作图,可得y轴截距为1的直线。依样品管的B0/B值,从标准曲线上得至相对应的浓度。再乘10得cAMPnmol/L。
5.6 正常值
3H-标记法:2.5~4.7nmol/mg·肌酐
5.7 化验结果临床意义
5.8 附注
(1)酰化试剂必须新鲜配制。琥珀酸酐丙酮液放4℃冰箱保存不应超过1个月。
(2)微孔薄膜分离B·F成本低廉,闪烁液可重复使用5次以上。该法为非均相测量,测量放射性的效率约20%~25%。