2 英文参考
Blood—Determination of carboxyhemoglobin—Spectrophotometric method
中华人民共和国卫生行业标准 WS/T 42—1996《血中碳氧血红蛋白的分光光度测定方法》(Blood—Determination of carboxyhemoglobin—Spectrophotometric method)由中华人民共和国卫生部于1996年10月14日发布,自1997年05月01日起实施。
4 2 原理
血液中含有四种血红蛋白成分,即还原血红蛋白(Hb)、氧合血红蛋白(HbO2)、碳氧血红蛋白(HbCO)及微量的变性血红蛋白(MetHb).用连二亚硫酸钠将HbO2和MetHb还原成Hb,则血液中只存在HbCO(Ⅰ)和Hb(Ⅱ)两种成分。Ⅰ的最大吸收波长在420 nm,Ⅱ的最大吸收波长在430 nm。测出被检血样在两个波长的吸光度,再利用Ⅰ与Ⅱ在两个波长下的摩尔吸光系数计算HbCO的百分浓度。
6 4 试剂
本标准所用试剂除另有说明者外,均为分析纯试剂。
4.2 硫酸,ρ20=1.84 g/mL。
4.3 甲酸.85%(m/m)。
4.5 氮气,高纯。
4.6 氧气,高纯。
4.7 一氧化碳纯气,钢瓶装或自制。制备方法:在装有滴液漏斗和气体导出管的烧瓶中加入甲酸(4.3).自滴液漏斗滴加浓硫酸,产生的一氧化碳通过内装氢氧化钠水溶液(4.8)的洗气瓶及缓冲瓶后通入样品液中。操作应在良好的通风橱内进行。
8 6 分析步骤
8.1 6.1 摩尔吸光系数的测定
摩尔吸光系数不易测定。但在本法计算中,可用同一浓度的血样制得Hb及HbCO,测其在420 nm,430 nm下的吸光值来代替,作为常数。测定方法如下:
取不吸烟健康人血(肝素抗凝)用水稀释5倍。取0.3 mL加Tris稀释液(4.9)至90 mL通氧气30 min。从中取4份,每份15 mL于具塞试管中。其中两份通氮气10 min以除去过剩的氧,得到HbO2液。另两份通纯一氧化碳气10 min,得到HbCO液。立即将HbO2、HbCO制备液分别转入内盛60 mg连二亚硫酸钠的具塞试管中,混匀,放置10 min测量。读取430 nm和420 nm的吸光度值,代替摩尔吸光系数(以下简称吸光常数)。
8.2 6.2 样品处理和测定
将冷藏的血样于室温放置,用液体混合器混匀。迅速取10μL(二个平行样),加入内盛15 mLTris溶液(4.9)的具塞试管中(若采样后随即分析,可直接取血10μL放入内盛15 mLTris溶液的试管中),加入60 mg连二亚硫酸钠,轻轻混匀放置10 min.用10 mm比色杯以试剂空白为参比,测其在420 nm和430 nm处的吸光度值。
9 7 计算
按下式计算血中HbCO的浓度。
式中:X——血中碳氧血红蛋白的浓度,%;
A420——血样在420 nm的吸光度读数;
A430——血样在430 nm的吸光度读数;
k1——HbCO在420 nm的吸光常数(6.1);
k2——HbCO在430 nm的吸光常数(6.1);
k3——Hb在420 nm的吸光常数(6.1);
k4——Hb在430 nm的吸光常数(6.1)。
10 8 说明
8.1 本法检测限(0.02吸光度对应的浓度)为2%HbCO。测定范围:2%~70.5%HbCO。精密度:批间变异系数为1.9%~5.6%(HbCO浓度为9.9%、36.6%、56.8%,n=6)。准确度:中毒病人血样加已知HbCO浓度血测定回收率,平均为95.8%(三个浓度,n=8)。
8.2 本法测定所依据的Hb与HbCO含量比例与血红蛋白含量高低无关,因此取血量不需要很准确。吸光度常数测定后只要仪器波长稳定,可较长时间使用。
8.3 空气中有大量氧气,所以血样及制成的待测液接触空气越少越好。实验证明含HbCO 20%及近饱和HbCO的待测液,其容器上端空气分别为5~6 mL及20 mL时,较装满或近满者,测定结果HbCO平均下降4.5%及10.2%(n=6)。
8.4 非高纯级的钢瓶氧气和氮气含有微量的一氧化碳。制备HbO2时应通过加热至80~100 C的1 cm×10 cm霍加拉特管除去之。
11 附录A 连二亚硫酸钠含量测定方法(补充件)
11.1 A1 试剂
A1.1 碘,0.1mol/L标准溶液。
A1.3 甲醛,250 g/L碱性甲醛溶液,用NaOH将甲醛溶液的pH调至8~9。
11.2 A2 测定
用预先盛有15 mL碱性甲醛溶液(A1.3)的30 mL高型称量瓶,称取约1g样品(称重至0.002 g)。待样品充分溶解后移于250 mL容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,吸出25 mL置于锥形瓶中,加水稀释至刻度,混匀,吸出25 mL置于锥形瓶中。加5 mL乙酸溶液(A1.4),2 mL淀粉溶液(A1.5),用0.1 mol/L碘溶液(A1.1)滴定至蓝色为终点。
11.3 A3 计算
连二亚硫酸钠的百分含量按式(A1)计算:
式中:
c——碘溶液的浓度,mol/L;
m——称取试样之质量,g;